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分光光度法測定葉綠素含量
發(fā)布時(shí)間： 2023-01-16 點(diǎn)擊次數(shù)： 1012次原理
葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對(duì)光、熱較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙-醚、丙酮和氯仿。
葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：
1.原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進(jìn)而間接計(jì)算葉綠素的含量。
2.分光光度法：利用分光光度計(jì)測定葉綠素提取液在最大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。
葉綠素a 和葉綠素b 在645nm 和663nm 處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm 波長下的吸光值，并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。
材料與儀器
植物材料
96％乙醇 丙酮 石英砂 碳酸鈣粉
分光光度計(jì) 電子頂載天平 研缽 棕色容量瓶 定量濾紙 吸水紙 擦境紙 滴管 漏斗步驟
1.取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3——5min。
2.取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?/p>
3.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用乙醇定容至100mL，搖勻。
4.取葉綠體色素提取液在波長665nm、645nm 和652nm 下測定吸光度，以95％乙醇為空白對(duì)照。
注意事項(xiàng)
1.光對(duì)葉綠素有破壞作用，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行，且應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)研磨。
2.色素提取液若混有其他物質(zhì)而造成渾濁，將影響吸光度的測定，應(yīng)重新過濾或離心。
3.色素吸光度測定前，應(yīng)按儀器說明及標(biāo)準(zhǔn)葉綠素 a 、 b 對(duì)分光光度計(jì)的波長進(jìn)行校正，否則影響葉綠素含量的測定精度。
常見問題
1.無水乙醇提取時(shí)間較長且對(duì)某些材料特別是木本植物的葉綠素提取不夠完-全。無水丙酮提取會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，影響比色測定。因此選用丙酮和無水乙醇混合提取葉綠素的效果較好，比列以2：1效果較佳。
2.傳統(tǒng)的80%丙酮法由于含水量過高，造成葉綠素穩(wěn)定性差，提取速度慢，測定值偏低，應(yīng)慎重采用。
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